PROCESADO DE TEJIDOS Y CITOPREPARACIONES.

lunes, 8 de junio de 2015

TALLADO

1) La fijaremos en formol en proporción 1:20 para detener los fenómenos de autólisis y putrefacción derivadas de la muerte celular con el fin de minimizar los cambios en su estructura y lograr que el patólogo pueda valorarla.

corazones de cordero fijados en formol

2) Mientras se completa el proceso de fijación, procederemos al registro de la muetra.
Se reflejara, de forma inmediata, en el libro de registros del laboratorio la filiación del paciente, el servicio de procedencia y la fecha y hora de procedencia del material. Imprescindible otorgar a cada muestra un número correlativo por orden de recepción.

3) Una vez tenemos nuestra muestra totalmente fijada continuamos con su preparación. Dependiendo del tipo de muestra se procederá a abrirla y vaciar su contenido en un recipiente de medición, extraer el líquido de los quistes y sustituirlo por líquido fijador.

4) Es en este paso donde se realiza el estudio macroscópico de la muestra, la descripción de esta detalladamente (dimensiones, lesiones, morfología, aspecto, coloración...) y por último la selección de las áreas representativas.

Los fragmentos tienen que tener un tamaño no superior a 3/5 mm de espesor para facilitar la infiltración de la parafina.

Posteriormente se introducirán en cestillas.

FIJACIÓN

Tenemos fragmentos de tejido fijados en formaldehido al 4%, dentro de casetes identificados. Una vez fijado, el material debe ser procesado para hacerlo observable al microscopio.

Casetes de distintos tipos:

Procesadora (abierta y cerrada):

Casetes en la cesta de la procesadora:

Las etapas de la procesadora son las siguientes:

Fijación (1 y 2): Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el organismo muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: la autolisis y la putrefacción. Se fija un tejido para preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en estado vivo.

Formol – 1 hora
Formol – 1 hora

Deshidratación (3 a 8): Eliminación completa de agua del espécimen para que pueda ser embebido en un medio de inclusión. (El más habitual es la parafina):

Etanol 70% – 1:30 horas
Etanol 80% – 1:30 horas
Etanol 96% – 1:30 horas
Etanol 100% – 1 hora
Etanol 100% – 1 hora
Etanol 100% – 1 hora

Aclaramiento (9 y 10): La sustitución del agente deshidratante por una sustancia que sea miscible en el medio de inclusión.

Xilol – 1:30 horas
Xilol – 1:30 horas

Infiltración en parafina (11 y 12): Tiene por objeto rellenar completamente la muestra con el medio de imbibición, con el que se construirá también el bloque a su alrededor.

Parafina – 2 horas (infiltración)
Parafina – 2 horas (infiltración)

Sacamos el cestillo con los casetes de la procesadora y los trasladamos a la estación de fabricación de bloques.

CONFECCIÓN DE BLOQUES

Una vez procesadas las muestras y la infiltración en parafina, procedemos a la fabricación de bloques. Es la obtención de un bloque sólido con el tejido en medio de inclusión, para que solidifique debe ser enfriado.

Para ello se utilizan las estaciones de inclusión o estaciones de confección de bloques, todas tienen: un dispensador de parafina, la cual es sólida a temperatura ambiente pero la pasamos a estado líquido por calor; una placa caliente para la orientación de las piezas con la parafina aún caliente, es decir, liquida; y una placa fría para la solidificación del bloque.

Estación de inclusión o estación de confección de bloques:

Pasos para la confección de los bloques:

Elegir un molde adecuado al tamaño de la muestra.

Aplicar un poco de parafina dentro del molde seleccionado y colocar la muestra con ayuda de las pinzas en la orientación deseada.

Llevar el molde a la zona fría y presionar la muestra con las pinzas para que quede fijada en la posición correcta.

Rápidamente, sin dejar pasar mucho tiempo para evitar grietas, etc., colocarle el casete encima del molde y completar de parafina.

Lo dejamos enseguida en la placa refrigeradora para que se complete de enfriar.

Una vez frío, lo desmoldamos y desbastamos

Ya tenemos nuestra muestra lista para cortar al micrótomo.

domingo, 7 de junio de 2015

CORTE CON MICROTOMO

QUÉ ES UN MICROTOMO:

Instrumento que se utiliza para conseguir cortes finos de tejidos que han sido incluidos en bloques de parafina para que después sean teñidos y poder observarlos al microscopio.

CÓMO SE CORTA:

Dejar el bloque en la placa refrigeradora y esperar a que se enfríe
Poner el bloque en el portabloques
Desbastar el bloque entre 15-20 micras y dejar la superficie lisa
Una vez liso, poner el bloque a enfriar en la palangana de cubitos
Poner el bloque en el porta bloques y cortar a 4-5 micras
Al salir la secciones las cogemos con unas pinzas y un pinzel y las llevamos al baño de agua fria
Con un punzon separamos las muestras y elegir las que mas nos interese
Con un portaobjetos recoger la muestra elegida
Llevarlo al baño de agua caliente y sumergir el portaobjetos para estirar la muestra
Recoger la muestra y dejarlo secar en el borde de la estufa

sábado, 6 de junio de 2015

TINCIONES

HEMATOXILINA - EOSINA

Las muestras se dejan en la estufa, por lo menos 10 minutos a 60ºC o toda la noche a 37ºC (desparafinación).
Xilol, 3 pasos de 5 a 10 minutos (final desparafinación).
Etanol, por lo menos 3 pasos, habitualmente 96º, 80º, 70º, de 3 a 5 minutos. Acabar con un paso de agua (hidratación).
La hematoxilina se debe filtrar antes de empezar.
Hematoxilina durante 3-5 minutos.
Llevar la cubeta a la pila.
Lavar la muestra en una cubeta con agua corriente de forma que rebose y eliminar el exceso de colorante.
La muestra se sumerge y se saca rápidamente en una cubeta con alcohol clorhídrico (0.5% de HCl en etanol absoluto) varias veces, para eliminar el exceso de coloración en la muestra (diferenciación).
Se neutraliza el ácido sumergiendo la muestra en agua corriente durante 2 minutos.
Lavar con agua corriente durante varios minutos. Pasar por agua destilada antes de seguir.
Sumergir la muestra en Eosina durante 3-5 minutos.
Baño rápido con agua.
Etanol, por lo menos 3 pasos, habitualmente 70º, 80º, 96º, de 3 a 5 minutos. Acabar con 3 pases de 100% (deshidratación).
Se acaba en xilol, en 2 o 3 cubetas, de 30 segundos a 5 minutos.
Montar de manera habitual.

TRICRÓMICO DE MASSON

Protocolo:

Las muestras se dejan en la estufa, por lo menos 10 minutos a 60ºC o toda la noche a 37ºC (desparafinación).
Xilol, 3 pasos de 5 a 10 minutos (final desparafinación).
Etanol, por lo menos 3 pasos, habitualmente 96º, 80º, 70º, de 3 a 5 minutos. Acabar con un paso de agua (hidratación).
La hematoxilina se debe filtrar antes de empezar.
Hematoxilina de Harris durante 3-5 minutos.
Llevar la cubeta a la pila.
Lavar la muestra en una cubeta con agua corriente de forma que rebose y eliminar el exceso de colorante.
Baño rápido con agua acética (1%).
Baño rápido con agua corriente.
Sumergir en Fucsina de Ponceau durante 5 minutos.
Baño rápido con agua corriente.
Baño rápido con agua acética 1%.
Sumergir en Orange G o Ácido Fosfomolibdico 1% (sale mejor con el ácido fosfomolibdico 1%) durante 5 minutos.
Baño rápido con agua acética 1%.
Sumergir en Azul de Anilina durante 10 minutos.
Baño rápido con agua corriente.
Baño rápido con agua acética 1%.
Baño rápido con agua corriente.
Baño rápido en etanol 70%, 6 sacudidas.
Baño rápido en etanol 80%, 8 sacudidas.
Baño rápido en etanol 96%, 10 sacudidas.
Baño en etanol 100%, 5 minutos.
Se acaba en xilol, en 2 o 3 cubetas, de 30 segundos a 5 minutos.
Montar de manera habitual.

viernes, 5 de junio de 2015

CYTOSPIN

Cytospin: Citocentrifugadora, a través del panel de control ajustaremos las revoluciones, la aceleración y el tiempo

Materiales: Citocontenedor (200 µl), filtro, portaobjetos y la pinza de cytospin